Arrangørene krever at statsminister Petr Fialas regjering går av og tar til orde for militær nøytralitet, selv om Tsjekkia er Nato-medlem.
Demonstrasjonen startet med slagordet «Tsjekkia først», og et band som anses for å være høyreekstremt, spilte nasjonalsangen.
En av hovedtalerne var Miroslav Ševčík, en økonomiprofessor fra Praha. Han hevdet at sanksjonene vil skade Vesten mest.
EU-parlamentarikeren Christine Anderson, som tilhører Tysklands ytre-høyreparti Alternativ for Tyskland (AfD), gjorde en gjesteopptreden.
– Din kamp er min kamp, sa den 54 år gamle tyske politikeren.
Mindre demonstrasjoner ble også holdt i byene Brno og Ostrava.